Quando microscópios foram inventados por volta de 1600 C. E., filósofos naturais voltaram os olhos para um mundo dentro de um mundo. Quando Antony van Leeuwenhoek trabalhada pequenas, lentes altamente curvadas e um suporte mecânico para ajustar o ponto de vista, abriu uma janela para o mundo microscópica de bactérias, células de sangue, protozoários e a estrutura celular das plantas. Mas ao longo da história da microscopia, houve sempre uma pergunta: O que são essas coisas estranhas visto através de uma lente? microscopia de fluorescência refere-se a um conjunto de técnicas que minimizem essa incerteza - porque em microscopia de fluorescência quando a luz é brilhou sobre uma amostra, que brilha sua própria luz de volta.
epifluorescência
De longe, o microscópio de fluorescência mais comum é a configuração de epifluorescência. Em um microscópio de epifluorescência, uma fonte de luz - normalmente uma lâmpada de mercúrio ou xenônio - brilha através de um filtro que seleciona uma região estreita de comprimentos de onda. A luz filtrada brilha sobre a amostra através da lente objectiva de microscópio. A luz que entra é absorvida por fluoróforos - etiquetas moleculares que emitem luz de um comprimento de onda longo quando absorvem luz de um comprimento de onda mais curto. Luz dos fluoróforos, juntamente com luz dispersa a partir da fonte de iluminação, volta para a lente objetiva e ao detector ou olho. Ao longo do caminho, um outro filtro bloqueia a luz de iluminação, por isso tudo o que resta é a luz fluorescente da amostra.
confocal
Um microscópio de epifluorescência, recolhe a luz de todo o lado no interior do campo de visão do microscópio. Uma parte da luz de excitação é absorvida antes do plano focal do microscópio, alguns no plano focal e alguns para além do plano focal. Porque o microscópio recolhe toda essa luz, a imagem irá conter uma imagem nítida de luz no foco, mas também terá a luz fora de foco de outras regiões. Um microscópio confocal que corrige, concentrando-se um ponto de laser no mesmo plano que o microscópio está focado. Depois, um furo de pino passa em frente do detector, onde ele bloqueia toda a luz que não vem a partir do foco microscópio. Ao digitalizar a amostra, pode ser obtida uma imagem tridimensional do objecto limpo.
multiphoton
Em um microscópio confocal o alinhamento é muito sensível. Se o ponto de laser, a objetiva do microscópio, a óptica de recolha ea pinhole estão fora até mesmo a menor quantidade que o desempenho do microscópio sofre. Um microscópio multiphoton fica em torno esse problema usando um comprimento de onda de laser que é apenas metade tão enérgico como ele precisa ser para excitar os fluoróforos na amostra. A única maneira que os fluoróforos vai ficar animado e emitem fluorescência é se a luz do laser é brilhante o suficiente para que duas partículas de luz - os fótons - atingem o fluoróforo em um tempo muito curto. Isso acontece apenas quando o laser é focado para uma muito pequena mancha. Assim, o único lugar na amostra que emite luz é onde o laser é focalizada, o que mantém a imagem agradável e limpo, porque não há luz de fundo extra para se livrar de - o que significa que não há pinhole para alinhar.
Reflexão interna total de fluorescência (TIRF)
Outra maneira de obter imagens muito limpas é certificar-se a luz de excitação não ir muito longe na amostra. Se uma gota de neurónios, por exemplo, é colocada em uma gota de solução numa lâmina de vidro, em seguida, alguns dos neurónios irá aderir à superfície do vidro. Em um microscópio de fluorescência de reflexão total interna (TIRF) a luz é dirigida lateralmente no lâmina de vidro para que ele não realmente fazê-lo na solução segurando as células. Mas alguma da luz apenas mal vaza para dentro da solução - apenas muito perto da superfície do vidro. Isto significa que os únicos lugares que emite luz será numa região muito fina à direita contra a superfície do vidro. Para algo como neurônios, onde tanta coisa interessante acontece na superfície das células, esta técnica pode ser muito eficaz.
Super-Resolution
Todos os microscópios - incluindo microscópios de fluorescência - são limitados pelos física que governa a propagação da luz. Uma das regras básicas é que um ponto de luz focalizado só pode chegar tão pequeno - e não menor. Para a luz visível, que o tamanho é cerca de 200 nanômetros, ou 200 bilionésimos de metro. Mas moléculas individuais são apenas alguns nanômetros de tamanho, por isso há muitas características interessantes que estão abaixo desse limite de tamanho, o chamado limite de difração. Os cientistas estão desenvolvendo "super-resolução" técnicas para burlar esse limite. microscopia de iluminação estruturada (SIM) e microscopia estimulada depleção de emissão (STED), por exemplo, são os dois métodos de microscopia de fluorescência, que limitam o tamanho do ponto de saída da luz, reduzindo o tamanho da mancha de luz de excitação.
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