Para determinar como uma das funções dos genes numa célula por transfecção de um gene para sobre-expressar-lo, é crítico para assegurar o ácido (ADN) de clonagem e de ligação desoxirribonucleico passo envolvendo um vector apropriado é bem sucedido. Se o passo de ligação não foi bem sucedida, ou se não inserção de ADN é inserido na orientação correcta, os dados irão ser não interpretável, e será impossível para determinar como o seu gene funciona na célula.
Coisas que você precisa
- Os iniciadores de PCR
- gel de agarose a 3 por cento
- plasmídeo não ligada
- O plasmídeo mais o ADN de inserção
- restrição apropriada enzimas para inserção especial de consumo
- glicerol contendo tampão de carga 4x
- O brometo de etídio ou outro agente intercalante de ADN
Criar reacção em cadeia da polimerase (PCR) para a sua inserção que incorpora um local de restrição para o novo iniciador. Por exemplo, o iniciador de PCR é de 18 nucleotídeos longo ao montante ou cinco prime ( `5) final adicione a sequência canónica de uma enzima de restrição que já não está dentro do plasmídeo. Isto irá permitir a clonagem unidireccional do inserto no plasmídeo. As sequências para os locais de restrição podem ser encontrados em sites de empresas que vendem as enzimas, tais como Current Protocols in Molecular Biology e New England Biolab, que estão ligadas na seção de Recursos.
Determinar o tamanho do produto de PCR. Para fazer isso, executar-se uma alíquota do produto de PCR num gel de agarose a 3 por cento, juntamente com um marcador de peso molecular apropriado. Isto também determina se ou não um só produto foi amplificado.
Sequenciar o produto de PCR.
Digite sequência na ferramenta de busca de alinhamento local básico (BLAST, BLASTN) para garantir que apenas o gene pretendida foi amplificado. A ferramenta de pesquisa está ligada na seção de Recursos.
Digerir o plasmídeo além de inserção utilizando as enzimas de restrição apropriadas. Fazer isso depois de o produto de PCR foi verificada e foi ligado no vector apropriado. Siga as instruções para o tempo de digestão e temperatura prevista com as enzimas.
Executar uma aliquota do plasmídeo restringido diluído em tampão de carga 4x contendo brometo de etídio ou outro agente intercalante de ADN para visualizar o DNA num gel de agarose. Se o inserto foi correctamente ligado no plasmídeo, dois fragmentos devem ser visíveis no gel.
Sequenciar o inserto para assegurar que foi incorporado na orientação correcta. Fazê-lo cortando o plasmídeo além de inserção utilizando enzimas de restrição que estão a montante e a jusante da inserção. primers projeto de seqüenciamento que incorporam alguns dos plasmídeo e inserir juntos na mesma cartilha. Isso vai lhe dizer definitivamente sobre a inserção ea orientação.
Como reparar um fio de alumínio
Como preparar um cocktail inibidor de protease
Como para calcular a temperatura de recozimento do iniciador
Como matar casa molde com enzimas
Como remover uma ordem de restrição início
Como lutar contra uma ordem de restrição temporária
Como obter uma ordem de restrição no Alasca
Como imprimir uma inserção que vai caber em um caso cd
Como fazer suas próprias inserções cd