De acordo com o site Bioweb da Universidade de Wisconsin de, um iniciador de PCR é um curto, oligonucleótido sintético (normalmente entre 18 a 25 bases de comprimento) utilizadas para amplificar regiões específicas de ADN, em uma técnica de biologia molecular conhecido como reacção em cadeia da polimerase (PCR). Tanto um iniciador em sentido directo e reverso são necessários, concebido para ser complementos reversos da cadeia de ADN, para flanquear e se ligam à região de ADN desejada. Quando os cientistas querem realizar pesquisas em um gene ou região de DNA específica, eles primeiro precisam realizar PCR para adquirir bastante de região-alvo para trabalhar. Projetar seqüências de primers para a região de interesse pode ser necessário se eles já não estão disponíveis através de pesquisa previamente publicado ou por meios comerciais.
Coisas que você precisa
- Sequência de nucleótidos da região de DNA alvo
- software de design Primer ou website
Se obter a sequência de nucleótidos da região do gene ou ADN de interesse e decidir durante quanto tempo um fragmento que pretende amplificar. O iniciador de sentido directo e inverso foi concebido para se ligar no início e no final do fragmento pretendido. Tipicamente, os métodos de PCR convencionais utilizam iniciadores que flanqueiam uma região entre 100 a 1000 pares de bases de comprimento, enquanto que em tempo real métodos de PCR utilizar fragmentos de cerca de 50 a 200 pares de bases de comprimento.
Decidir onde na seqüência você quer os iniciadores de mentir. Por exemplo, você pode querer a localização perto do 5 `ou 3` fim da sequência ou no meio. Se desejado, designam a localização dos iniciadores para abranger um intrão.
Siga as orientações recomendadas para o projeto primer. uma amplificação bem sucedida de produto de DNA depende da qualidade dos iniciadores e certas variáveis são críticas.
Conceber iniciadores para ser de 18 a 24 bases de comprimento. Vincent R. Prezioso, Ph.D., Brinkmann Instruments Inc., sugere que este comprimento é suficientemente longo para ser extremamente específico para a região de ADN desejada, mas suficientemente curto para se ligar (recozimento) facilmente. Primer temperatura de fusão (Tm) deve situar-se entre os 55 e os 80 graus Celsius, baixa o suficiente para permitir a fusão completa a ou acima de 90 graus Celsius, mas suficientemente elevado para permitir o emparelhamento. O conteúdo de GC (percentagem de Gs e Cs em sequência) deve situar-se entre 40 e 60 por cento. A extremidade 3 `da sequência do iniciador deve terminar em um C ou um G (chamado um grampo de GC) para promover a ligação, uma vez que os nucleótidos G e C possuem ligações mais fortes, no entanto, evitar ter três ou mais Gs ou Cs nos últimos cinco bases da sequência.
Evite ter corridas de quatro ou mais de uma base (como ACCCC ...) ou quatro ou mais repetições di-nucleotide (como ATATATAT ...), porque eles podem causar err�ea. iniciadores de concepção sem homologia intra-iniciador (mais de três bases que complementam dentro do próprio um iniciador) ou homologia inter-iniciador (em que o iniciador de sentido directo e inverso têm sequências que complementam). Isto pode provocar a auto-dimeros ou os dimeros de iniciadores, em que os iniciadores se ligam a si mesmas, em vez de se ligar à sequência de ADN desejada.
Use recursos on-line e sites que auxiliam no desenho de primers ou ajudar a verificar seqüências de primers para a auto-complementaridade ou o potencial de fazer estruturas secundárias, como grampos de cabelo. Alguns sites de design primário incluem Massachusetts Institute of Primer3 de Tecnologia, Centro Nacional de Primer-Explosão de Biotecnologia da Informação e OligoAnalyzer Tecnologias de ADN integradas ».
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