Para a reação em cadeia da polimerase para amplificar corretamente DNA, você precisa de dois iniciadores adequadamente feitos, ou cadeias curtas de nucleótidos que são complementares à primeira parte do segmento de DNA que está sendo copiado. PCR é usado para uma variedade de aplicações que vão desde a aplicação da lei para a engenharia genética. Trata-se de tomar uma amostra de ADN de cadeia dupla, o qual funde a sua quebra-se o ADN em cadeias separadas, anexando os iniciadores para as cadeias simples, e depois estendendo-se os iniciadores para formar dois fragmentos de DNA de cadeia dupla. Este processo é repetido de modo a obter uma amostra várias vezes a concentração do original.
O iniciador directo que você estará fazendo deve corresponder-se com o DNA no lado oposto, ou cadeia complementar. Em outras palavras, deve ser constituído pelos primeiros nucleótidos da sua sequência de interesse. O iniciador inverso tem para se ligar ao fim do seu gene de interesse e imitar a sua cadeia complementar.
Usando um processador de texto ou programa mais especializado para o DNA, olhar para a sequência de DNA que você deseja ampliar. Tome nota das primeiras 18-24 pares de bases e os últimos 18-24 pares de bases. Eles não devem ser encontrados em outros lugares em sua amostra de DNA, o que pode ser comum para as áreas que se repetem. Se isso acontecer, você vai acabar com a ligação a várias áreas de sua cartilha dentro de sua amostra e resultados de PCR de comprimento variável.
Anote os primeiros e últimos segmentos de DNA que você estava olhando na primeira etapa. Por exemplo, digamos que a sequência começando era ATGGAATTCACGATCGATCGT ea última foi GGGTGCGAACACGGACTTAG. Neste exemplo, estamos priming para o início e fim de um determinado gene.
Tome a primeira 18-24 pares de bases de sequência (no exemplo, é ATGGAATTCACGATCGATCGT) e inseri-lo em outro documento para fazer o primer para a frente. Salve-o com o nome da região que estão preparando para eo fato de que é um primer para a frente.
Anotar os últimos 18-24 pares de bases da sequência de interesse (GGGTGCGAACACGGACTTAG no exemplo) para criar o iniciador inverso. Adicione os nucleótidos complementares para a sequência que representa o outro lado. Cada uma das quatro bases de um pares de nucleótidos com uma única outra base: adenina (A) com timina (T) e citosina (C) com guanina (G). Depois de ter a outra cadeia complementar, que deseja inverter a ordem de todos os nucleotídeos da cadeia, reescrevendo-a na direção oposta. Quando isso for concluído, tome a sua sequência recém-completados e inverteu e salve-o em um documento devidamente rotulados.
Ir para o site do seu fornecedor e inserir a sequência com a conta relevante de faturamento (geralmente ligada a um laboratório), concentração e quaisquer outras modificações especiais. Faça seu pedido.
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