Um genoma humano é constituído de 3 x 10 ^ 9 pares de bases dentro de 24 cromossomos, ainda não toda esta informação genética é usada. As regiões activas do genoma são denominados "genes," que detêm as informações usadas para produzir proteínas. Um gene é transcrito pelo ácido ribonucleico mensageiro (ARNm), que em última análise é traduzido pelos ribossomas em proteína.
Os vectores de expressão são utilizados na área da biotecnologia para a produção de muitas cópias de uma proteína específica. Por exemplo, a insulina usada para tratar a diabetes é produzido em massa com a ajuda de vectores de expressão.
A construção de um vector de expressão
Determinar a sequência de ADN da proteína específica. Uma vez que a sequência de ADN da proteína é determinada, cortar a sequência de DNA a partir do genoma utilizando uma enzima de restrição específica. As enzimas de restrição de reconhecimento e corte a uma sequência específica do genoma.
Inserir o DNA específico no vector. Um vector é uma molécula de ADN que introduz ADN estranho numa célula hospedeira, utilizando enzimas da célula para produzir a proteína a partir do ADN estranho.
Inserir uma sequência de promotor a jusante do gene de interesse. Um promotor é uma região que é reconhecida pela ARN-polimerase, que se liga à sequência e começa a transcrição do gene. Adicionar a enzima ligase para ligar a sequência do promotor para o gene de interesse.
Inserir o vector de expressão numa célula hospedeira por meio de transformação, induzindo furos transientes (usando sal) na membrana da célula. O vector de expressão pode então ser transcrita por ARNm e traduzida em proteína.
Triagem para um vector de expressão
Executar um teste de rastreio para determinar se a célula hospedeira tem o vector de expressão. A célula hospedeira é primeiro plaqueadas utilizando a técnica asséptica (passando o equipamento através de uma chama) para uma placa de ágar para o crescimento de cultura de células.
Transferir algumas células a partir da placa de agar em um disco de papel de nitrocelulose. Quebrar as células no disco, tratando-as com sal. Isto irá libertar o conteúdo da célula para o disco.
Submergir o disco de papel de nitrocelulose com uma solução de uma sonda de anticorpo específico com um marcador fluorescente. O anticorpo ligar-se à proteína produzida pelo ADN de interesse.
Exponha o disco de papel de nitrocelulose à luz UV. Se a célula tem o vector de expressão, a célula irá fluorescência sob luz UV devido à ligação do produto de proteína com o anticorpo com um marcador fluorescente.
Extrair o produto de proteína através de purificação métodos- que podem então ser usadas para fins medicinais.
dicas & avisos
- Use equipamento de proteção quando se utiliza luz UV no processo de triagem.
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