Como para fazer um padrão de calibração para uma hplc

Determinar a química que você deseja testar para o uso do HPLC (a "substância"). Por exemplo, você pode querer testar uma série de refrigerantes para teor de frutose, caso em que a frutose seria a analisar.

Obter uma quantidade do produto químico analito de pureza adequada. Normalmente pureza deve estar acima de 99% e substância a analisar deve ser comprado de uma empresa de fornecimento de produtos químicos respeitável. No caso de frutose, por exemplo, você iria comprar frutose pura de um fornecedor de produtos químicos e não a partir de uma mercearia.

Determinar as concentrações antecipado máximas e mínimas da substância a analisar nas amostras que você pretende testar no HPLC. No caso de refrigerantes, você iria examinar os rótulos das bebidas e determinar o menor e maior teor de frutose entre as bebidas que você irá testar. Tenha em atenção que a amostra inicial (o refrigerante) pode ser diluído ou de outro modo manipulado durante a preparação para análise (dependendo do método de HPLC de ser utilizado) e por isso a concentração de analito em amostras realmente injectada na HPLC pode ser modificado. Ele é a concentração de analito em amostras como executado na HPLC que deve ser considerado.

Determinar o solvente em que você vai dissolver o analito para tornar-se padrões de calibração. Este solvente deve ser capaz de se dissolver adequadamente o analito ao longo de um intervalo relativamente grande de concentração (pelo menos tão elevado como nas amostras que pretende testar). Assim, este solvente deve, idealmente, ser bastante semelhante à "fase móvel:" o solvente usado para transportar amostras através do instrumento de HPLC.

Calcular a quantidade de analito necessária para fazer uma solução "padrão de reserva" da substância a analisar. Isto é encontrado multiplicando a concentração necessária do padrão de reserva pelo volume desejado. A concentração da substância a analisar na solução deve estar presente, pelo menos, 10% mais elevada do que a concentração mais elevada de amostra esperado. Se a concentração mais elevada frutose esperado numa amostra de refrigerante é de 8 gramas / 100 ml, em seguida, o padrão da poderiam ser feitas a uma concentração de 10 gramas de frutose / 100 mililitros. Um volume razoável é de 500 mililitros, portanto, 8/100 ml x 500 mL = 40 gramas de frutose seriam necessários.

Pesar a quantidade necessária de substância a analisar para um nível adequado de precisão. Muitas vezes, um valor de peso em gramas precisos para uma ou duas casas decimais é adequado, mas mais precisão pode ser necessária para alguns métodos.

Transferir o analito pesados ​​para um balão volumétrico de o volume necessário e adicionar o solvente desejado para a marca de enchimento no frasco. Utilização de um frasco volumétrico (em vez de uma proveta graduada, por exemplo) aumenta a precisão do valor da concentração padrão. Assegure-se que toda a substância é transferida para o uso flask- um pouco de solvente de lavá-lo em, se necessário.

Tapar o balão volumétrico e agite ou inverter até que a substância esteja completamente dissolvido.

Adicione uma série de diferentes diluições do padrão de reserva através da transferência de volumes conhecidos de o padrão de reserva em balões volumétricos, usando pipetas de transferência precisa, em seguida, adição de solvente. A menor concentração padrão deverá ser inferior ao esperado menor amostra a ser analisada. No exemplo de refrigerantes, se a menor concentração de frutose esperado numa amostra é de 2 gramas / 100 ml, em seguida, um padrão de 1 grama / 100 ml poderia ser feito. Isto seria feito através de uma diluição de dez vezes do padrão de reserva. A série padrão deve incluir um total de 5 ou 6 concentrações, assim diluições adicionais para produzir padrões de talvez 3, 5 e 8 gramas de frutose / mL seria necessário. Você tem agora uma série de soluções padrão com o qual calibrar o HPLC.