Componentes de tampões de lise

Os tampões estabilizar o pH, enquanto que as células estão a ser submetidas a lise. Tris-HCL é um tampão comum para tamponante a pH 8- se o pH for desejado, HEPES é outro produto químico amortecedor comum nestas experiências. sal de cloreto de sódio pode também ser incluída para aumentar a força iónica, a concentração total de solutos fora das células. Este último é importante, pois a água pode difundir através das membranas celulares a partir de regiões de baixa concentração de soluto para regiões de alta concentração de soluto.

O detergente é o ingrediente fundamental que se dissolve a membrana da célula para que o conteúdo possa escapar. Os detergentes são moléculas anfipáticas, i.e., moléculas com uma extremidade que interage prontamente com moléculas de água, enquanto o outro hidrófobo ou "Temente a água" final não. Podem dissolver as gorduras por micelas que formam, pequenos agrupamentos onde as caudas hidrófobas das moléculas de detergente apontam para dentro em direcção as moléculas de gordura. detergentes comuns incluem o dodecil sulfato de sódio ou de SDS, NP-40 e tritonX.

tampões de lise tipicamente também incluem agentes quelantes como o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou ácido tetracético de etileno-glicol (EGTA). Estes produtos químicos para ligar iões metálicos com uma taxa de 2 (por exemplo, magnésio e cálcio), tornando-os assim indisponíveis para outras reacções. Muitos ADNases (proteínas que mastigam o DNA) e proteases (proteínas que dividem-se outras proteínas) precisam de íons de magnésio para funcionar, por isso, privando-os desse ingrediente chave, EDTA e EGTA ajuda a reduzir o nível de protease ou atividade DNAse. Eles não descartá-la completamente, no entanto, e algumas proteases não dependem de cofatores magnésio, por isso tampões de lise por vezes também incluem produtos químicos chamados inibidores da protease, que se ligam a proteases e impedi-los de funcionar correctamente.

lise alcalina é uma técnica muito comum para a purificação de plasmídeos a partir de bactérias. Este método envolve três soluções. O primeiro contém glicose, tampão de Tris-HCl, EDTA e ARNases. A glicose cria uma concentração alta de soluto fora das bactérias para que eles se tornam um pouco flácida, o que os torna mais fáceis de lyse- o EDTA e função tris-HCL como já foi descrito, enquanto que a RNAse vai mastigar qualquer RNA dentro da célula para obtê-lo fora do caminho. A segunda solução realmente lisa as células. Este contém um detergente SDS e NaOH, que aumenta o pH a 12 ou superior, desnaturação de proteínas no interior da célula e fazendo com que o ADN a separar-se em cadeias simples. A terceira solução contém acetato de potássio para restaurar o pH a um nível mais neutra de modo que as cadeias de ADN de plasmídeo pode voltar juntos. Enquanto isso, as proteínas desnaturadas e aglutinam-se precipitar, enquanto que os iões de brometo de dodecil-sulfato de vir em conjunto com os iões de potássio para formar um composto insolúvel, que também precipita a partir da solução.