Como para optimizar a expressão de proteínas

Prepare dois ou mais de cinco mililitros (ml) de culturas de sua proteína, adicionando uma colônia de bactérias a partir de uma placa de agar contendo sua proteína em uma amostra de 5 ml de meio LB. Crescer as culturas durante a noite com agitação a 37 graus Celsius.

Adicionar 500 microlitros de cada cultura durante a noite a uma cultura separada contendo 50 ml de LB na manhã seguinte e colocá-los num agitador a 37 Celsius.

Permitir que as culturas a crescer até a absorvância a 600 nm atingir 0,6 (fase de crescimento exponencial). Medir a absorção usando um espectrofotômetro apagado com a mídia LB. Uma vez que a absorção atinge 0,6, permitir que as culturas a crescer durante diferentes pontos de tempo. Os pontos de tempo sugeridos são 3 horas, 6 horas, 12 horas, 18 horas e 24 horas.

Verifique a absorvência depois de cada ponto de tempo e conservar amostras de igual densidade celular para cada uma cultura num tubo de Eppendorf de 1,5 ml. Como referência, uma absorvância de 1 a 600 nm corresponde tipicamente a uma densidade celular de cerca de 10 ^ 9 células / ml. Ajustar a quantidade de cada amostra de salvar de acordo com a absorção.

Repita os passos acima, mas em vez de tentar diferentes pontos de tempo, tentar temperatura diferente, colocando 50 ml culturas em shakers de várias temperaturas, uma vez absorvância atinge 0,6. temperaturas sugeridas são 37 ° Celsius, 30 ° Celsius, 21 ° Celsius ou 18 ° Celsius. Permitir a crescer por um momento de sua escolha. Repita recolha de amostras, tal como descrito no Passo 4.

Prepare culturas conforme descrito na Seção 1, Etapas 1 e 2.

Adicionar IPTG até uma concentração final de 1 milimolar de uma cultura uma vez que a absorvância a 600 nm atingir 0,6. O sistema de expressão pET é controlada pelo promotor lac, que é o local onde se liga a RNA polimerase para iniciar a transcrição do gene. IPTG desloca o repressor lac, uma proteína de ligação de ADN que se liga perto do promotor e impede ligação da polimerase de ARN. Deslocamento do repressor permite a ligação de ARN polimerase e a transcrição do gene.

Adicionar 5 por cento de sacarose para uma cultura após a absorvância atingiu 0,6. A sacarose é uma fonte de carbono para o crescimento bacteriano.

Adicionar tanto IPTG e sacarose para uma terceira cultura. agora você terá pelo menos 4 culturas: uma com nada adicionado para um controle, um com IPTG acrescentou, uma com sacarose adicionada, e um tanto com IPTG e sacarose adicionada.

Permitir que as culturas a crescer por um tempo e a uma temperatura de sua escolha e recolher amostras conforme descrito na Seção 1, Passo 4.

Centrífuga todas recolhidas amostras à velocidade máxima em uma centrífuga de mesa. Descartar o líquido, deixando pellet no fundo do tubo.

Ressuspender pelotas bacterianas em um por cento OTG, um detergente que quebra as células.

Executar uma análise em gel de SDS-PAGE em todas as amostras recolhidas e monitorizar os níveis de sua expressão de proteína em cada amostra. A condição de crescimento que produz a expressão mais proteína é o que você deve usar para o crescimento escala completa, purificação e caracterização de sua proteína.

Variar os tipos de mídia se a expressão ainda é difícil. opções alternativas incluem Super Caldo e Terrific Broth.

Vary linhagens de células bacterianas se expressão ainda é difícil. estirpes comuns de E. coli utilizados para a expressão são nomeados BL21 (DE3) e JM109 e são conhecidas por sobre-expressar proteínas bem.

Teste diferentes combinações de tempo de crescimento, temperatura, e de indução, se necessário. Estes podem também ser testados em diferentes meios de cultura e estirpes bacterianas.